PCRje polymerázová řetězová reakce, která se týká přidání dNTP, Mg2+, elongačních faktorů a faktorů zesilujících amplifikaci do systému za katalýzy DNA polymerázy, s použitím mateřské DNA jako templátu a specifických primerů jako výchozího bodu extenze, Prostřednictvím kroků denaturace, nasedání, extenze atd. může proces in vitro replikace dceřiného řetězce DNA komplementárního k templátové DNA rodičovského vlákna rychle a specificky amplifikovat jakoukoli cílovou DNA in vitro.
1. Hot Start PCR
Počáteční čas amplifikace u konvenční PCR je nevložení PCR přístroje do PCR přístroje a poté program začne amplifikovat.Po dokončení konfigurace systému začne amplifikace, která může způsobit nespecifickou amplifikaci, a hot-start PCR může tento problém vyřešit.
Co je hot start PCR?Po přípravě reakčního systému se modifikátor enzymu uvolní při vysoké teplotě (obvykle vyšší než 90 °C) během počáteční fáze zahřívání reakce nebo fáze „horkého startu“, takže se aktivuje DNA polymeráza.Přesná doba aktivace a teplota závisí na povaze DNA polymerázy a modifikátoru horkého startu.Tato metoda používá hlavně modifikátory, jako jsou protilátky, afinitní ligandy nebo chemické modifikátory k inhibici aktivity DNA polymerázy.Vzhledem k tomu, že aktivita DNA polymerázy je inhibována při pokojové teplotě, poskytuje technologie horkého startu velké pohodlí pro přípravu více PCR reakčních systémů při pokojové teplotě bez obětování specifičnosti PCR reakcí.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) je experimentální technika pro reverzní transkripci z mRNA do cDNA a její použití jako templátu pro amplifikaci.Experimentálním postupem je nejprve extrahovat celkovou RNA v tkáních nebo buňkách, použít Oligo (dT) jako primer, použít reverzní transkriptázu k syntéze cDNA a poté použít cDNA jako templát pro PCR amplifikaci pro získání cílového genu nebo detekci genové exprese.
3. Fluorescenční kvantitativní PCR
Fluorescenční kvantitativní PCR (Kvantitativní PCR v reálném čase,RT-qPCR) se týká způsobu přidávání fluorescenčních skupin do reakčního systému PCR, pomocí akumulace fluorescenčních signálů k monitorování celého procesu PCR v reálném čase a nakonec pomocí standardní křivky ke kvantitativní analýze templátu.Mezi běžně používané metody qPCR patří SYBR Green I a TaqMan.
4. Nested PCR
Nested PCR označuje použití dvou sad PCR primerů pro dvě kola PCR amplifikace a produktem amplifikace druhého kola je fragment cílového genu.
Pokud neshoda prvního páru primerů (vnějších primerů) způsobí amplifikaci nespecifického produktu, možnost, že stejná nespecifická oblast bude rozpoznána druhým párem primerů a bude pokračovat v amplifikaci, je velmi malá, takže amplifikací druhým párem primerů se zlepšila specifita PCR.Jednou z výhod provedení dvou kol PCR je, že pomáhá amplifikovat dostatečné množství produktu z omezené výchozí DNA.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR je metoda ke zlepšení specifity PCR reakce úpravou parametrů PCR cyklu.
V touchdown PCR je teplota nasedání pro prvních několik cyklů nastavena o několik stupňů nad maximální teplotou nasedání (Tm) primerů.Vyšší teplota nasedání může účinně snížit nespecifickou amplifikaci, ale současně vyšší teplota nasedání zhorší separaci primerů a cílových sekvencí, což vede ke snížení výtěžku PCR.Proto je v prvních několika cyklech teplota nasedání obvykle nastavena tak, aby se snížila o 1 °C na cyklus, aby se zvýšil obsah cílového genu v systému.Když se teplota žíhání sníží na optimální teplotu, teplota žíhání se udržuje po zbývající cykly.
6. Přímá PCR
Přímá PCR označuje amplifikaci cílové DNA přímo ze vzorku bez nutnosti izolace a purifikace nukleové kyseliny.
Existují dva typy přímé PCR:
přímá metoda: odeberte malé množství vzorku a přidejte jej přímo do PCR Master Mix pro PCR identifikaci;
metoda krakování: po vzorkování vzorku jej přidejte k lyzátu, lyzujte, aby se uvolnil genom, odeberte malé množství lyžovaného supernatantu a přidejte jej do PCR Master Mix, proveďte PCR identifikaci.Tento přístup zjednodušuje experimentální pracovní postup, zkracuje čas nutný k použití a zabraňuje ztrátě DNA během purifikačních kroků.
7. SOE PCR
Genový sestřih pomocí překryvné extenzní PCR (SOE PCR) využívá primery s komplementárními konci, aby produkty PCR vytvořily překrývající se řetězce, takže v následné amplifikační reakci, prostřednictvím prodloužení překrývajících se řetězců, mohou být různé zdroje techniky A, ve které se amplifikované fragmenty překrývají. a spojeny dohromady.Tato technologie má v současnosti dva hlavní aplikační směry: konstrukce fúzních genů;genová místně řízená mutace.
8. IPCR
Inverzní PCR (IPCR) používá reverzní komplementární primery k amplifikaci fragmentů DNA jiných než dva primery a amplifikuje neznámé sekvence na obou stranách známého fragmentu DNA.
IPCR byl původně navržen k určení sekvence sousedních neznámých oblastí a většinou se používá ke studiu genových promotorových sekvencí;onkogenní chromozomální přeuspořádání, jako je genová fúze, translokace a transpozice;a integrace virového genu, se nyní běžně používají. Pro místně cílenou mutagenezi zkopírujte plazmid s požadovanou mutací.
9. dPCR
Digitální PCR (dPCR) je technika pro absolutní kvantifikaci molekul nukleové kyseliny.
V současné době existují tři metody pro kvantifikaci molekul nukleových kyselin.Fotometrie je založena na absorbanci molekul nukleové kyseliny;fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase (PCR v reálném čase) je založena na hodnotě Ct a hodnota Ct odkazuje na číslo cyklu odpovídající hodnotě fluorescence, kterou lze detekovat;digitální PCR je nejnovější Kvantitativní technologie založená na jednomolekulární metodě PCR pro počítání nukleových kyselin Kvantifikace je absolutní kvantitativní metoda.
Čas odeslání: 13. června 2023