Použití a opatření pro ultrafiltrační centrifugační zkumavku
1) Vyberte vhodnou ultrafiltrační trubici.Všimněte si, že UF membrány se liší úrovní tolerance vůči různým chemikáliím.Typicky lze ultrafiltrační zkumavky s mezní hodnotou molekulové hmotnosti 10 kDa vybrat s mezní hodnotou molekulové hmotnosti, která by neměla být větší než 1/3 molekulové hmotnosti zájmového proteinu, jako je 35 kDa.Pokud je molekulová hmotnost sledovaného proteinu kolem 10 kd, lze použít ultrafiltrační zkumavku s limitem molekulové hmotnosti 3 kD.
(2) Ultrafiltrace, čerstvě zakoupená, je suchá, před použitím se přidá ultračistá voda a voda zcela projde přes membránu, ledovou lázeň nebo chladničku předchlazenou na několik minut.Poté se slije voda, tj. proteinová tekutina, a jaké množství se přidá, podle toho, která hodnota není větší než bílá čára v horní části zkumavky.Operace je nenáročná a ultrafiltrační zkumavka musí být před přidáním proteinového roztoku předchlazena na ledu.
3) Hmotnost i těžiště měly dosáhnout rovnováhy.Všimněte si, že rychlost otáčení a zrychlení nejsou příliš rychlé, jinak přímo poškozují ultrafiltrační membránu.Byla zahájena odstředivá ultrafiltrace (odstředivka předem ochlazená na 4 stupně).Poté, co byly otáčky různých odstředivek převedeny na g, bylo to jiné.Zrychlení odstředivky bylo nastaveno na minimum, čímž se snížil tlak na membránu.Pozor, odstředivku opusťte poté, co odstředivka dosáhne cílové rychlosti, nebo pokud máte problém, napoprvé s ním nezvládnete.Orientace membrány vůči vřetenu byla upravena podle instrukcí (úhlové pouzdro odstředivky je membrána k ose kolmá).Při praktickém použití je obecná rychlost otáčení nižší než v návodu, takže lze prodloužit životnost centrifugační zkumavky.
3) Hmotnost i těžiště měly dosáhnout rovnováhy.Všimněte si, že rychlost otáčení a zrychlení nejsou příliš rychlé, jinak přímo poškozují ultrafiltrační membránu.Byla zahájena odstředivá ultrafiltrace (odstředivka předem ochlazená na 4 stupně).Poté, co byly otáčky různých odstředivek převedeny na g, bylo to jiné.Zrychlení odstředivky bylo nastaveno na minimum, čímž se snížil tlak na membránu.Pozor, odstředivku opusťte poté, co odstředivka dosáhne cílové rychlosti, nebo pokud máte problém, napoprvé s ním nezvládnete.Orientace membrány vůči vřetenu byla upravena podle instrukcí (úhlové pouzdro odstředivky je membrána k ose kolmá).Při praktickém použití je obecná rychlost otáčení nižší než v návodu, takže lze prodloužit životnost centrifugační zkumavky.
(4) Po zahuštění na zbývající 1 ml odeberte 50 ul roztoku pufru, přidejte 10 ul protečeného roztoku a zjistěte, zda je nějaké modré zbarvení, abyste mohli posoudit, zda v ultrafiltrační zkumavce nechybí protein.Pokud je zkumavka netěsná, znovu nalijte horní vrstvu a protečte do nové zkumavky, aby se spustila ultrafiltrace.Chcete-li přesně určit, zda nedošlo k vynechání zkumavek, centrifugujte po dobu 10 minut s 5 mg ml BSA před průtokem, proveďte na proteinovém lepidle nebo Bradfordově surovém testu a pokračujte přidáním zbývajícího koncentrovaného proteinového roztoku (který funguje na ledu a zabraňuje zahřívání proteinů), dokud byl přidán veškerý koncentrát.Během centrifugace buďte opatrní, pokud nedojde k vysrážení proteinů, což by mohlo vést k uzavření zkumavky.Pokud dojde k precipitaci, určete, zda je specifickou příčinou precipitace nadměrná koncentrace proteinu nebo nevhodný pufr;První lze vyřešit ultrafiltrací několika ultrafiltračních zkumavek současně, snížením koncentrace, a druhý výměnou různých pufrovacích roztoků, dokud nedojde k vysrážení proteinu.
(4) Po zahuštění na zbývající 1 ml odeberte 50 ul roztoku pufru, přidejte 10 ul protečeného roztoku a zjistěte, zda je nějaké modré zbarvení, abyste mohli posoudit, zda v ultrafiltrační zkumavce nechybí protein.Pokud je zkumavka netěsná, znovu nalijte horní vrstvu a protečte do nové zkumavky, aby se spustila ultrafiltrace.Chcete-li přesně určit, zda nedošlo k vynechání zkumavek, centrifugujte po dobu 10 minut s 5 mg ml BSA před průtokem, proveďte na proteinovém lepidle nebo Bradfordově surovém testu a pokračujte přidáním zbývajícího koncentrovaného proteinového roztoku (který funguje na ledu a zabraňuje zahřívání proteinů), dokud byl přidán veškerý koncentrát.Během centrifugace buďte opatrní, pokud nedojde k vysrážení proteinů, což by mohlo vést k uzavření zkumavky.Pokud dojde k precipitaci, určete, zda je specifickou příčinou precipitace nadměrná koncentrace proteinu nebo nevhodný pufr;První lze vyřešit ultrafiltrací několika ultrafiltračních zkumavek současně, snížením koncentrace, a druhý výměnou různých pufrovacích roztoků, dokud nedojde k vysrážení proteinu.
(5) Prvních několik kroků se používá ke koncentraci proteinu, a pokud má být pufr vyměněn, jemně přidejte nový pufr (ultrafiltrace přes 0,22um ultrafiltrační membránu) k přibližně 1 ml celkového proteinu a znovu zakoncentrujte na přibližně 1 ml po dobu tří po sobě jdoucích časech, přičemž konečný koncentrovaný konečný objem závisí na požadované koncentraci proteinu, obecně ne více než 500 ul, ale také do 200 ul.Dosáhněte třikrát nebo více 1000× nebo více, v podstatě tolik, kolik se změnilo pufru, jak se pokaždé vypočítá alespoň 10× obohacením objemu.
(5) Prvních několik kroků se používá ke koncentraci proteinu, a pokud má být pufr vyměněn, jemně přidejte nový pufr (ultrafiltrace přes 0,22um ultrafiltrační membránu) k přibližně 1 ml celkového proteinu a znovu zakoncentrujte na přibližně 1 ml po dobu tří po sobě jdoucích časech, přičemž konečný koncentrovaný konečný objem závisí na požadované koncentraci proteinu, obecně ne více než 500 ul, ale také do 200 ul.Dosáhněte třikrát nebo více 1000× nebo více, v podstatě tolik, kolik se změnilo pufru, jak se pokaždé vypočítá alespoň 10× obohacením objemu.
Čas odeslání: List-09-2022